Preparo do tampão PCR com sulfato de amônio
Este guia descreve o preparo de um tampão de PCR com sulfato de amônio em uma molaridade definida para uso em laboratório.
O tampão de PCR com sulfato de amônio é comumente usado para aumentar a especificidade dos primers e otimizar a atividade da DNA polimerase.
Tampão de PCR com sulfato de amônio – Composição
| Nome | Fórmula | Concentração | CAS |
|---|---|---|---|
| Sulfato de amônio | (NH₄)₂SO₄ | 20 mM | 7783-20-2 |
| Tris-Cl (pH 8.8) | C₄H₁₁NO₃ | 75 mM | 77-86-1 |
| Cloreto de magnésio | MgCl₂ | 2 mM | 7791-18-6 |
| Triton X-100 | C₃₄H₆₂O₁₁ | 0.1% (w/v) | 9002-93-1 |
Esterilização e armazenamento
- Esterilização: filtração de 0.22 μm.
- Armazenamento: dividir em alíquotas e armazenar a −20 °C.
Dicas
- O pH do tampão geralmente é de 8.0–9.5, ajustado com Tris-Cl.
- O Triton X-100 é muito viscoso; usar uma solução estoque de baixa concentração ou substituí-lo por Tween 20.
- Quando se usa sulfato de amônio, a concentração de MgCl₂ geralmente é maior (2.0 ± 0.5 mM).
- NH₄⁺ e Mg²⁺ apresentam efeitos antagônicos; tampões com sulfato de amônio mostram maior especificidade dos primers em diferentes faixas de concentração de Mg²⁺.
- Os íons amônio desestabilizam as ligações de hidrogênio entre primer e molde com pareamentos incorretos, aumentando a especificidade da reação.
- O tampão de PCR ideal depende do tipo de DNA polimerase; seguir as recomendações do fornecedor.
- O uso direto de MgCl₂ anidro é exotérmico; adicionar em pequenas porções a uma parte do volume de solvente.
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