Herstellung des Ammoniumsulfat-PCR-Puffers
Diese Anleitung beschreibt die Herstellung eines Ammoniumsulfat-PCR-Puffers mit einer festgelegten Molarität für den Laborgebrauch.
PCR-Puffer mit Ammoniumsulfat wird häufig eingesetzt, um die Primerspezifität zu erhöhen und die Aktivität der DNA-Polymerase zu optimieren.
PCR-Puffer mit Ammoniumsulfat – Zusammensetzung
| Name | Formel | Konzentration | CAS |
|---|---|---|---|
| Ammoniumsulfat | (NH₄)₂SO₄ | 20 mM | 7783-20-2 |
| Tris-Cl (pH 8.8) | C₄H₁₁NO₃ | 75 mM | 77-86-1 |
| Magnesiumchlorid | MgCl₂ | 2 mM | 7791-18-6 |
| Triton X-100 | C₃₄H₆₂O₁₁ | 0.1% (w/v) | 9002-93-1 |
Sterilisation und Lagerung
- Sterilisation: Filtration mit 0.22 μm.
- Lagerung: Aliquotieren und bei −20 °C lagern.
Hinweise
- Der pH-Wert des Puffers liegt gewöhnlich bei 8.0–9.5 und wird mit Tris-Cl eingestellt.
- Triton X-100 ist sehr viskos; eine niedrig konzentrierte Stammlösung verwenden oder durch Tween 20 ersetzen.
- Bei Verwendung von Ammoniumsulfat ist die MgCl₂-Konzentration typischerweise höher (2.0 ± 0.5 mM).
- NH₄⁺ und Mg²⁺ wirken antagonistisch; Puffer mit Ammoniumsulfat zeigen über verschiedene Mg²⁺-Konzentrationsbereiche hinweg eine höhere Primerspezifität.
- Ammoniumionen destabilisieren Wasserstoffbrücken bei Fehlpaarungen zwischen Primer und Matrize und erhöhen dadurch die Reaktionsspezifität.
- Der optimale PCR-Puffer hängt vom Typ der DNA-Polymerase ab; die Empfehlungen des Lieferanten beachten.
- Die direkte Verwendung von wasserfreiem MgCl₂ ist exotherm; in kleinen Portionen zu einem Teil des Lösungsmittelvolumens geben.
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