Herstellung des RIPA-Lysepuffers
Diese Anleitung beschreibt die Herstellung eines RIPA-Lysepuffers mit einer festgelegten Molarität für den Laborgebrauch.
RIPA-Lysepuffer (Puffer für Radioimmunpräzipitationsassays) ist ein häufig verwendeter Zell-/Gewebelysepuffer zur Extraktion von Gesamtproteinen, einschließlich Membran-, Zytoplasma- und Kernproteinen. Durch seine Mischung aus ionischen und nichtionischen Detergenzien solubilisiert er Proteine wirksam und erhält dabei viele antigene Epitope für nachfolgende Verfahren wie Western Blot und Immunpräzipitation.
RIPA-Lysepuffer – Zusammensetzung
| Name | Formel | Konzentration | CAS |
|---|---|---|---|
| Tris‑Cl (pH 7.4) | C₄H₁₁NO₃ | 50 mM | 77‑86‑1 |
| Natriumchlorid | NaCl | 150 mM | 7647‑14‑5 |
| NP‑40 | (C₂H₄O)nC₁₄H₂₂O | 1% (v/v) | 26027‑38‑3 |
| SDS (optional) | C₁₂H₂₅O₄NaS | 0.1% (w/v) | 151‑21‑3 |
| Natriumdesoxycholat | C₂₄H₃₉NaO₄ | 0.5% (w/v) | 302‑95‑4 |
| EDTA (optional) | C₁₀H₁₆N₂O₈ | 1 mM | 60‑00‑4 |
Sterilisation und Lagerung
- Sterilisation: In der Regel nicht erforderlich; detergenzienhaltige Puffer werden bei Bedarf üblicherweise filtriert (0.22 μm), aber nicht autoklaviert, um den Abbau von Detergenzien oder EDTA zu vermeiden.
- Lagerung: Raumtemperatur oder 4 °C; Arbeitsaliquots während der Verwendung auf Eis halten.
Hinweise und Anmerkungen
- Protease- und Phosphataseinhibitoren (z. B. Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin, PMSF, Na₃VO₄, NaF) unmittelbar vor Gebrauch zugeben, um Proteinabbau zu verhindern; PMSF ist in wässriger Lösung instabil und sollte erst direkt vor Gebrauch zugesetzt werden.
- Triton X‑100 kann in einigen Rezepturen als Ersatz für NP‑40 verwendet werden.
- Für Anwendungen, bei denen Protein–Protein-Interaktionen erhalten bleiben sollen, Puffer mit milderen oder ohne ionische Detergenzien in Betracht ziehen.
- Die Natriumdesoxycholat-Konzentration kann je nach Zelltyp und erforderlicher Lysestärke angepasst werden (typischerweise im Bereich von 0.1–1%).
- Alle Lyseschritte auf Eis oder bei 4 °C durchführen, um Proteolyse und Denaturierung zu minimieren.
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